085-鉴定差异基因时的一些问题

刘小泽写于19.2.15

先来看一个例子

如果得到的表达矩阵如下：

发现：

• gene1在低抗样本中的表达量在50左右，而在高抗样本中表达量达到100左右，的确差异是比较大的。差异可能是真实的表达丰度差异，也可能是高抗样本测序抽样时抽到了更多的reads
• gene2在高抗的样本中reads数相比低抗更多，但是总体却很少，这种情况不能排除随机波动带来的影响
• gene3在低抗样本中的reads数平均值是50，在高抗中是100，看平均数的话确实是高抗表达量更高一些，但是由于高抗-3的值相比高抗-1和高抗-2差别太大，不能排除异常值（测序错误）的影响

建库测序是随机抽样的过程

同一样本的两次测序，同一基因的reads count数也会出现差异

因此，如果发现两个样本的reads count不同时，先别着急判断它们是真的表达丰度差异，还要考虑随机抽样过程中的波动。

既然一开始我们没有办法排除随机抽样的波动影响，那么我们可以先做一个假设，然后计算在随机抽样波动的前提下，出现目前这种情况的概率是多少，如果概率比较低就表示随机抽样波动情况很难发生，那么就更有可能是真实的表达丰度导致

上面的方法日常称之为反证法，统计学中称之为假设检验

• 首先假设gene1在低抗和高抗两个样本中的表达是没有差异的

• 根据实际情况选择合适的检验方法：z检验、t检验、卡方检验 需要考虑：是否已知总体的均值、方差；单样本还是多样本；重复数量多少（大样本 vs 小样本） 通常使用t检验，最后得到一个T值。t检验的公式自行搜索，其中分子表示组间差异，分母表示组内差异。因此，组间差异越大，组内差异越小，t值就越大，越有可能是差异表达基因【因此为何推荐测更多的生物学重复=》这也是其中一个原因=》重复越多，对组内差异的估计越准确；不建议混样测序=》会丢失组内差异信息】

• 得到T值的分布=》T分布

  曲线下面积表示出现在某个区域的概率，假入计算的T值在右侧竖线的位置，那么竖线右侧红色区域的面积就是P-value。

  可以看到，T分布是对称的，如果要看gene1在高抗样本中的表达是不是大于低抗样本，只需要看右侧区域的面积【单侧检验】；如果要看gene1在高抗和低抗样本中是否有差异，就需要计算两侧的面积【双侧检验】

既然假设检验是统计学知识，那么就存在错误的可能

有时将非差异表达基因鉴定成为差异表达基因=》一类错误/假阳性/误诊率=》与P value对应=》通过设置P value阈值进行控制【这个阈值就是我们常用的0.05或者0.01】，即每一百次判断中可能有5次/1次将非差异表达基因鉴定成了差异表达基因

例如：

有时将差异基因误诊为非差异基因=》二类错误/假阴性/漏诊率

假设得到的gene3的P值是0.36，大于0.05，无法拒绝原假设【但并不是说gene3不是差异表达基因】，此处只是表示证据不足，无法判断

如何降低两类错误呢？

• 对于一类错误：比如可以设置阈值为0.05，即对于一条基因只有5%的机会误诊，但是差异基因鉴定是大批量基因，如果有1万条基因还是按5%，就有50条基因出现误诊，这个比例就比较高

  针对这个问题，开发出了对P value校正的办法，例如FDR以及升级版q-value

  如果只是关注某一条基因在样本间的差异，那么看P value就好了；如果关注整体的差异情况，一般就要看FDR、q-value

• 对于二类错误：目的要减少漏诊，主要由于证据不足，无法拒绝原假设。例如gene3就可以通过增加重复，而对于gene2，整体表达量不高，可以再提高测序量

需要再强化的知识点有

正态分布、中心极限定理、均值、方差、z-score、z检验、t检验、卡方检验