230-测序质控中的per base GC content需要关注吗
刘小泽写于2021.1.22
先看一组chipseq的QC结果
看上去总体质量还不错，Q30、Q20表现良好。但是这个perbase sequence content 就有点奇怪，另外接头也没有去除，被标记为overrepresented sequences（黄色标出来的就是Truseq接头序列）
$ cat Truseq_adaptor.fa
>TruSeq_Universal_Adapter
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
>TruSeq_Adapter_Index_1
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>TruSeq_Adapter_Index_2
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGATGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>TruSeq_Adapter_Index_3
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTAGGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>TruSeq_Adapter_Index_4
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGACCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>TruSeq_Adapter_Index_5
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACAGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>TruSeq_Adapter_Index_6
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCCAATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>TruSeq_Adapter_Index_7
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCAGATCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>TruSeq_Adapter_Index_8
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACTTGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>TruSeq_Adapter_Index_9
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGATCAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>TruSeq_Adapter_Index_10
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAGCTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>TruSeq_Adapter_Index_11
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGCTACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>TruSeq_Adapter_Index_12
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTGTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
去接头
trimmomatic SE in.fastq in_trimmed.fastq ILLUMINACLIP:Truseq_adaptor.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36
再看下结果
看到这时总体质量值有所提高，而且GC content也正常了很多（一般来说，由于chipseq是DNA测序，理论上ATCG应该各占25%），此处看似AT更高一点（因为看最后一张图，总体碱基的GC还不到50%）；另外，接头序列也去除了。此时就可以继续进行比对了
另一组RNAseq的结果
当然，RNAseq与chipseq存在着很多不同，下图中，从上到下依次是：Chipseq、RNAseq、WES、WGS
- 最上面是ChIP-seq数据，首先，测序深度都不高，而且测序深度极度的不稳定，深浅不一；其次，整个基因区域似乎都有覆盖到。
- 第二层是RNA-seq：只有exon对应的区域是有reads覆盖的，非常exon和intron的间隔非常明显。由于是PE测序，还可以看到不同的exon被同一个read跨越了intron连接起来了。测序深度而言，某一个基因的大部分exon都是等深度的，但是一个基因与其它基因的测序深度就不一样了
再回到之前的RNAseq质控图
- per-base content 很奇怪没有关系，造成这种现象的原因一般是： “random” hexamer effect，因为RNAseq和DNAseq不一样，它的扩增不是均一的。而且大部分人的RNAseq数据都是这样，也不需要去除这部分
- RNAseq的duplicates情况也很常见。首先，样本即使做了ribodepletion处理，其中依然可能含有rRNAs；另外，任何高表达基因都可能出现PCR重复
- 其他几个补充链接：https://www.biostars.org/p/55648/、https://www.biostars.org/p/66831/、https://www.biostars.org/p/14283/
